许建阳1 王发强1王梅康1刘庆安1宋开源2 杨介宾2
(1、武警总医院 北京 100039 2、成都中医药大学 )
摘 要：目的 为了系统比较不同时辰、不同机体状态，在镇痛方面的不同作用，并阐述其作用机制。方法 实验在“阳虚”、“阴虚”模型的基础上，进行截肢术造成创伤痛模型，电针“太溪”和“足三里”，以免疫组化的方法检测Fos蛋白的表达。结果 不同时辰电子表针对“阳虚”、“阴虚”大鼠创伤痛有一定的治疗作用和镇痛效应。电针可使其痛阈提高，电针可抑制创伤痛诱导的下丘脑Fos蛋白的表达。其具有明显的昼夜节律性。基本探明“阳虚”大鼠电针镇痛的最时机在卯时；“阴虚”的则在酉子时，两者呈相互对应性。结论 择时针刺治疗痛证，具有增强镇痛效应，为临床提供了重要的参考依据，具有一定的理论和实际意义。
关键词：电针/针刺镇痛 创伤痛/痛阈 下丘脑 基因表达/Fos蛋白 昼夜节律/单个余弦法
肇始于五十年代末的针刺镇痛原理研究，经过国内外学者大量临床和基础方面的研究，已获得了丰富的针刺镇痛知识，而且取得了许多令人瞩目的成果（1）。针刺镇痛效应，是由多种因素决定的（2）。其中机体状态和时间因素是非常重要而值得进一步探讨的问题。因针刺镇痛调整作用是以机体生理机能、病理变化为基础，而机体有着自身固有的生理、生化等节律。近年来随着时间生物学的发展，掀起了对生物节律研究高潮,目前对时间针法的研究做了大量的工作，至今尚无突破性进展。随着分子生物学的迅猛发展,开创了现代生物学的新时代。 基因表达与疾病发生的关系是医学分子生物学研究的核心。原癌基因c-fos属于在缺乏蛋白合成条件下，其mRNA能被诱导的基因，由于刺激后的快速一过性表达，其的显示不仅可用于明确伤害性反应神经元，同时，也适于检验多种因素调节伤害性反应通路活性的神经机制。对于c-fos的研究做了一些工作，但对不同时空、不同机体状态下同一细胞和同一机体状态下不同细胞c-fos的表达是否相同，这一问题值得进一步研究，对揭示针刺镇痛的本质有重要而深远的意义。
1.不同时辰电针前后对“阳虚”、“阴虚”大鼠痛阈的影响
1.1.材料与方法
1.1.1. 动物选择：
选用健康SD成年大鼠150只中筛选出96只，体重200±20g，雄性，全价颗粒饲料均由四川省输血研所实验动物中心提供。动物在实验前驯养1周，并进行筛选，其标准是：以辐射热灯照射左后足热部，测定在5秒(s)左右能引起缩腿反应者用于实验，而少于2s大于10s者表示动物反应过敏或迟钝，则弃之不用。在光照时12∶12(黑暗期为19∶00—7∶00，光照期为7 ∶00—19∶00)条件下驯养2周，自由饮水，取食。
1.1.2分组及处理
实验开始时，将动物随机分为以下3组，并分别予以相应处理。
A.正常对照组：8只/时辰，不造模。于实验前与造模组同样方法固定20min。
B.阳虚组：8只/时辰，造模与醋酸氢化可的松注射液(江苏扬州制药厂，批号9604291)，肌肉注射，用量，20mg/kg bw/d,用药10天，停药10天后电针20min。
C.阴虚组：8只/时辰，造模，促肾上腺皮质激素(ACTH)(上海生物化学制药厂，批号：9605319) 腹腔注射，用量，16微克/kg bw/d，用药4天后电针20min。
1.1.3电针方法：
先将大鼠用鼠夹固定，选取左后肢的“太溪”、“足三里”取穴依据《兽医针灸学 》（4），并参照人体有关穴位，以动物比较学方法定位。(太溪足少阴肾经之原、俞穴配以足阳明胃经多气多血之经的合穴足三里，二穴相配，阴阳上下，共同达到镇痛作用)，用0.5寸毫针，直刺0.3 —0.5cm，连接WQ—10C型多用电子穴位测定治疗仪，选用疏密波型，频率20—100Hz交替， 电压2—4V，波宽：0.2—0.6ms，电针时间：20min。
1.1.4指标检测方法
1.1.4.1痛阈的测定
在大鼠左后足掌心处固定点，用自制弹簧棒测定。测定时，让动物保持安静，测试者将弹簧棒均匀下压，直至动物发生缩腿反应，共测3次，每次间隔5分钟，取其均值。
1.1.4.2实验数据的统计方法
实验数据采用多个样本均数比较，方差分析，q检验(Newman-Keuls法)，t检验及t'检验处理和单个余弦法处理。
1.2.结果与分析
1.1不同时辰电针对“阳虚”、“阴虚”大鼠创伤痛针刺前后痛阈的影响(X±SD)
组别 子 卯 午 酉
A （n=8） （n=8） （n=8） （n=8）
针前 9.625±2.29 8.750±1.60 7.417±2.71 7.625±2.64
针后 9.083±2.49 9.417±1.16 6.083±2.11 9.625±2.64*
B
针前 10.50±2.45 8.469±1.58 10.563±1.57 9.938±1.12
针后 11.719±3.45 13.219±2.56△△** 6.938±1.49* 9.063±2.71
C
针前 3.531±0.70●●△△4.063±2.42●●△△ 3.281±1.11●●2.594±0.59
针后 7.563±1.29● 7.031±1.09●●△8.231±1.76 8.094±0.94**
注：与针前组比*P<0.05 ，**P<0.01与A组比△P<0.05 ，△△<0.01
与B组比●P<0.05 ，●●P<0.012
从表1.1得出，A组、B组和C组在针刺前后痛阈有不同的昼夜节律变化。针前 ：A组痛阈值波动不大，子卯较高、午酉较低；B组痛阈值较A组高，其中午时最高；C组痛阈 值较A组低，其中卯时最高(P<0 .01)；针后：A组痛阈增加(除午时外)，其中酉时较针前有显著性差异(P<0.05)，具有昼夜节律性 ；B组针后痛阈明显升高(除午时外)，其中午时(P<0.05)和卯时(P<0.01)有统计学意义，C 组痛阈明显升高，具有昼夜节律性，其中午时(P<0.05)和酉时(P<0.01)有显著性差异。
“阳虚”组与“阴虚”组比较，“阳虚”组针后痛阈最高在卯时，“阴虚”组痛阈最高在酉时，两组相比针效正好呈180°，提示“阳虚”组在卯时针刺效果最佳；“阴虚”组在酉时针刺疗效最宏。
2.不同时辰电针抑制“阳虚”、“阴虚”大鼠创伤痛诱导的下丘脑Fos蛋白表达的影响
2.1.材料与方法
2.1.1 动物选择
选用健康SD成年大鼠 224只，其余同实验1
2.1.2分组及处理
实验开始时将动物随机分为7组，按四个时辰(子、卯、午、酉)分别处理。
A正常对照组：8只/时辰，不造模，于实验前与电针同样方法固定，20min。
B正常+创伤截肢组：8只/时辰，于实验前30min在大鼠左后足踝关节下0.5cm行截肢术，压迫止血。与电针组同样方法固定 20min。
C正常+截肢+电针组 8只/时辰。
D阳虚+截肢组：8只/时辰。
E阳虚+截肢+电针组：8只时辰。
F阴虚+截肢组：8只/时辰。
G阴虚+截肢+电针组：8只/时辰。
2.1.3主要试剂：
免抗c-fos抗体，(购自北京中山生物技术有限公司，为SANTA(RU2产品)ABC试剂盒(含DAB染色剂,为华美生物工程公司产品)其它试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.4灌注取材及切片
用0.3％戊巴比妥钠以30mg/kg剂量麻醉大鼠。麻醉后将大鼠仰卧放置，开胸经左心室进行主动脉插管，剪开右心耳，首先迅速灌注100ml灭菌生理盐水，然后灌注250ml，4℃ 4％多聚甲醛(PFA)固定液，灌注后取大鼠脑 ，在同一固定液中后固定6-12h，然后浸入20 ％蔗糖PBS液中直至组织块下沉。在恒冷箱切片机(-17—-22℃)内做脑，连续切片（按照Paxinos和Watson的鼠脑图谱（3），选取所需的断面），片厚20μm，切片下后再入上述固定液中固定4-6h备用。
2.1.5指标检测方法
2.1.5.1 c-fos检测法(免疫组织化学ABC法)
切片入0.01mol/L PBS (pH7.4)中洗10min×3次；0.3％tritonx-100中30min；0.3％ H202 -PBS液中15min；0.01mol/L PBS中洗10min×3次；入正常羊血清PBS液中孵育20min；进兔抗C-fos 抗体中孵育；0.01mol/L PBS说10min×3次；入生物素标记羊抗兔IgG中 孵育；0.01mol/L PBS 洗10min×3次，入ABC复合物中孵育；0.01mol/L PBS洗10min×3次 ；DAB染色；双蒸水终止染色，用铬明胶将切片贴于载玻片上，过液凉干；梯度酒精脱水； 二甲苯透明；中性树胶封片。
2.1.5.2 免疫组化对照试验
2.1.5.3非特异性对照
用正常羊血清代替c-fos 抗体，其它步骤与免疫组化ABC法程序相同。
2.1.5.4 阴性对照
用PBS代替c-fos 抗体，其它步骤与免疫化ABC法程序相同。
2.1.5.5 Fos 样免疫反应性(FLI)的性细胞计算方法，
在每一动物的组织切片中随机抽样4张，每张切片选下丘脑区域的左上、右上，左下，右下和中央部五个视场进行阳性细胞计数取平均值。其图像处理均在四川联大计算机图像处理中心进行处理。